Роль системы матриксных металлопротеиназ в формировании клинических вариантов течения гипертрофической кардиомиопатии

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кожевникова М.В., Шакарьянц Г.А., Каплунова В.Ю.

Роль системы матриксных металлопротеиназ в формировании клинических вариантов течения гипертрофической кардиомиопатии

В основе патогенеза гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) лежат мутации в генах, кодирующих сократительные белки кардиомиоцитов. Дезориентация и гипертрофия кардиомиоцитов, а так же интерстициальный фиброз относят к морфологическим проявлениями заболеваниям [1]. Установлено, что матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы участвуют в процессах ремоделирования миокарда при ГКМП, что может играть важную роль в формировании клинического варианта течения заболеваниям [2, 3]. В ряде исследований были получены данные о влиянии полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ (ММП) и генов, кодирующих компоненты ренин-ангиотензин-альдостероновой системы на развитие гипертрофии миокарда, пролиферацию фибробластов, нарушение фибринолиза, и накопление внеклеточного матрикса, то есть, факторов, участвующих в ремоделировании сердечно-сосудистой системы [4, 5, 6, 7, 8].

Среди возможных маркеров прогнозирования течения заболевания обсуждается роль ММП и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (TIMP — tissue inhibitor of metalloproteinase) [9, 10, 11, 12].

Цель исследования

Изучение полиморфизмов генов, кодирующих систему МПП и РААС (ММР-3, AGT, AGTR1, CYP11B2, CMA-1) и маркеров образования фиброза (ММР-3, TIMP-1, TIMP-2, коллаген IV типа) в формировании клинических вариантов течения ГКМП

Материал и методы исследования

В исследование были включены 112 человек: 58 больных с ГКМП (24 мужчины и 34 женщины) и 54 здоровых добровольцев (22 мужчин и 32 женщины), которые составили контрольную группу. Средний возраст участников составлял 48,4±13,6 лет и статистически значимо не различался между группами (р = 0,95).

Диагноз ГКМП устанавливали в соответствии с клиническими рекомендациям по диагностике и лечению больных ГКМП.

В зависимости от вариантов клинического течения заболевания больные ГКМП были разделены на три группы: 1 группа — стабильное течение (n=21; 36,2% больных); 2 группа — вариант течения с фибрилляцией предсердий — ФП)  n = 10 (17,2%); 3- прогрессирующее течение ГКМП  n = 27 (46,6%).  Больные с клиническими вариантами «внезапная смерть от осложнения заболевания сердца» и «конечная стадия» в группу наблюдения не вошли.

Эхокардиографическое исследование

Эхокардиографическое исследование ( Vivid7 Dimension/Vivid 7 PRO версия 6.0.х, Германия) выполняли по методу  двухмерной эхокардиографии с использованием М и В режимов, а также с использованием импульсно-волнового допплеровского и непрерывно-волнового допплеровского режимов. Оценивали размеры камер сердца, показатели гипертрофии миокарда, в том числе толщину межжелудочковой перегородки (ТМЖП) и толщину задней стенки левого желудочка (ТЗСЛЖ), коэффициент асимметрии (КА). Так же оценивали показатели диастолической дисфункции, глобальную и локальную сократимость миокарда. Согласно стандартизованным математическим формулам,  производили вычисление параметров гипертрофии миокарда: индекса массы миокарда ЛЖ (ИММЛЖ), массы миокарда ЛЖ (ММЛЖ) и параметров, характеризующих диастолическую дисфункцию: отношения между наполнением ЛЖ в диастолу (пик Е) и систолу предсердий (пик А) (Е/А),   предсердно-желудочкового отношения (ПЖО), индекса объем – масса (ИОМ).

 Анализ полиморфизмов генов-модификаторов:

Всем участникам исследования (n=112) определяли полиморфизмы матриксной металлопротеиназы — 3 (MMP-3 -1171 rs3025058),  химазы (СМА1 A(-1903)G rs1800875), ангиотензиногена (AGТ M235T rs699), рецепторов ангиотензина II 1 типа (AGTR1 A1166C rs5186), альдостеронсинтазы (CYP11B2 -344 T/C rs1799998).

Использовались образцы ДНК, выделенные из периферической крови. Затем выполнялась полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза ДНК и рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов ДНК. Амплификация проводилась с помощью ПЦР на термоциклере «Терцик» производства компании «ДНК технология». Разделение амплифицированных фрагментов ДНК выполняли при помощи электрофореза.

Определение биологических маркеров

На основе количественного твердофазного иммуноферментного анализа 40 больным из группы ГКМП и 39 из контрольной группы проводили определение биологических маркеров: ММР-3 с использованием набора «BMS2014 Bender Medsystems Матриксная металлопротеиназа-3 (MMP-3), 96»; TIMP-1 с использованием набора «BMS2018 Bender Medsystems Тканевой ингибитор металлопротеиназы-1 (TIMP-1), 96»; TIMP-2  с использованием набора «DTM200 BCM Diagnostics Тканевой ингибитор металлопротеиназы-2 (TIMP-2), 96»; а так же коллагена IV  с использованием набора  «BIO82 BCM Diagnostics Коллаген IV типа в сыворотке, 96».

 Статистический анализ

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2010, Statistica (V. 6.0).  Вид распределения для количественных признаков оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнения количественных данных, распределение которых отличалось от нормального, выполняли с помощью  критерия Манна—Уитни или критерия Краскела—Уоллиса.  Для парного сравнение частот генотипов аллелей использовали точный двусторонний критерий Фишера. Для трех и более категорий применялся  однофакторный дисперсионный анализа (ANOVA), где вероятность случайного различия определялась по критерию Фишера p(F). Для сравнения качественных признаков применяли критерий χ². Различия считались статистически значимыми при р < 0,05. Если р было в диапазоне от 0,1 до 0,05, то результат оценивали как тенденцию.

 Результаты

Маркеры образования фиброза

Значения TIMP-1 в группе больных ГКМП были статистически значимо ниже по сравнению с показателями в контрольной группе (для средних значений [p(F)<0,001], для сумм рангов [p(H)<0,001] и медиан [p(χ²)=0,0001]; таблица 1)

Установлено  повышение концентрации маркера ММР-3 в группе больных с вариантом фибрилляция предсердий по сравнению с группами — стабильного течения (Р1-2=0,024) и прогрессирующего течения (Р2-3=0,028) (таб. 2).

Различий в концентрациях ТIMP-2  и коллагена IV между группой больных ГКМП и контрольной группой, а так же между подгруппами по вариантам течения не обнаружено (см. таблицу 1).

Таблица 1. Показатели маркеров р=образования фиброза в группах больных ГКМП и контроля*

Группа TIMP-1 нг/мл TIMP-2

нг/мл

ММР-3

нг/мл

Коллаген IV

нг/мл

 
 
Контрольная группа 804,1±28,1 75,74±2,47 32,05±5,85 141,58±5,78  
        ГКМП Стабильное течение 683±90 74,5±6,9 19±5,47 147,63±7,7  
фибрилляция предсердий 566,8±19,3 69,14±11,76 37,61±21,19 143,14±10,36  
Прогрессирующее течение 635,7±33,1 66,06 ±6,37 25,86±4,4 141,99±7,35  
Значение р p<0,001 р= 0,151 р1-2=0,024

р2-3=0,028

p= 0,983  

Примечание. * Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. TIMP-1 — тканевой ингибитор металлопротеиназы 1-го типа, TIMP-2 — тканевой ингибитор металлопротеиназы 2-го типа, ММР-3 — матриксная металлопротеиназа 3-го типа. р — статистическая значимость различий между данными в группе ГКМП и контрольной группе, р1-2 — статистическая значимость различий между группами стабильного течения и фибрилляции предсердий,  р2-3 — статистическая значимость различий между группами группами фибрилляции предсердий и прогрессирующего течения.

По данным анализа, связи между клинико-морфологическими показателями у больных ГКМП и уровнем маркеров образования фиброза, установлена обратная связь между средней степени между уровнем маркера маркером ММР-3  и показателем ТЗСЛЖ (r= –0,313; p=0,049) и прямая связь этого показателя с коэффициентом асимметрии (КА) (r=0,337; p=0,047; рисунки 1 и 2). Оценка корреляционных связей других изучаемых маркеров (TIMP-1, TIMP-2 и коллагена IV) с клиническими проявлениями заболевания не показала значимых зависимостей. 

Рисунок 1. — Корреляционная связь уровня маркера матриксной металлопротеиназы – 3 с коэффициентом асимметрии.

По вертикальной оси: H-MMP-3 – маркер матриксной металлопротеиназы -3 (нг/мл);  по горизонтальной оси: КА – коэффициент асимметрии.

Рисунок 2. — Корреляционная связь маркера ММР-3 с толщиной задней стенки левого желудочка (ТЗСЛЖ).

По вертикальной оси: H-MMP-3 – маркер матриксной металлопротеиназы -3 (нг/мл);  по горизонтальной оси: ТЗСЛЖ – толщина задней стенки левого желудочка (см).

Полиморфизм матриксной металлопротеиназы- 3 (MMP-3 -1171)

Полученные данные указывали на наиболее частую встречаемость аллельного варианта 6A/5A как в группе  ГКМП (43,86%), так и в контрольной группе (50,91%) Таб. 2. По проведенным ранее нами исследованиям генотип 6А/5А был определен как неблагоприятный аллельный вариант [13].

Таблица 2. —  Частота встречаемости генотипов полиморфизма MMP-3 -1171

у больных ГКМП и здоровых добровольцев.

  MMP-3
5А/5A 6A/5A 6A/6A
ГКМП (n) 13 25 19
  (%) 22,81% 43,86% 33,33%
Контроль (n) 12 28 15
 (%) 21,82% 50,91% 27,27%
N общ. 25 53 34
Значение р p=0,724

Примечание. ГКМП — гипертрофическая кардиомиопатия.

При анализе показателей гипертрофии миокарда и параметров диастолической дисфункции (ПЖО, ИОМ, Е/А) таб. 3, было выявлено, что неблагоприятный аллельный вариант изучаемого полиморфизма гена ММР-3 связан с гипертрофией межжелудочковой перегородки (р=0,074). (таблица 3

Таблица 3. — Показатели выраженности гипертрофии миокарда и диастолической дисфункции в зависимости от наличия неблагоприятного генотипа 5A/6A полиморфизма MMP-3 -1171.

 Показатель неблагоприятный генотип 5A/6A MMP-3 -1171  Значение р
Есть

(n=25)

 Нет

 (n=32)

ТМЖП см 2,168±0,116 1,886±0,103 р=0,074
ТЗСЛЖ см 1,184±0,042 1,181±0,037 р = 0,956
ИММЛЖ г/м2 125,728±7,111 115,853±6,41 р=0,307
ММЛЖ г 238,128±10,681 218,35±9,627 р=0,174
ПЖО 1,053±0,051 0,993±0,046 р=0,388
ИОМ мл/г 0,373±0,036 0,43±0,031 р=0,237
Е /А 1,033±0,664 0,894±0,578 р = 0,9

Примечание. MMP-3 -1171 — полиморфизм гена матриксной металлопротеиназы – 3 , ТМЖП – толщина межжелудочковой перегородки, ТЗСЛЖ — толщина задней стенки левого желудочка, ММЛЖ — масса миокарда ЛЖ, ИММЛЖ – индекс массы миокарда левого желудочка, ПЖО – предсердно-желудочковое отношение, ИОМ – индекс объем/масса, E/A — отношения скоростью раннего (Е) и позднего диастолического наполнения (А) левого желудочка.

Установлено, что изучаемый полиморфизм гена матриксной металлопротеиназы — 3 (MMP-3 -1171) оказывал влияние только на уровень маркера TIMP-1 (р=0,008).  Для носителей генотипа 6А/5А изучаемого полиморфизма было характерно снижение концентрации TIMP-1 по мере нарастания тяжести заболевания. Повышение средних значений TIMP-1  в группе больных с вариантом ФП было характерно для носителей генотипа 5А/5А. В то же время достоверных различий концентраций TIMP-1 между носителями разных генотипов этого полиморфизма не выявлено (р=0,291).

Было установлено, что на уровень TIMP-1 также оказывают влияние полиморфизмы генов AGTR1 (р=0,008), СМА1 (р=0,075).

Для генотипа АС гена AGTR1 по мере роста тяжести заболевания было характерно снижение средних значений ТIMP-1  (стабильное течение 1071±20 нг/мл, фибрилляция предсердий 645,6±52,7 нг/мл, прогрессирующее течение 459,5±31,5 нг/мл). Вероятно, генотип АА оказывал стабилизирующее действие на уровень ТIMP-1 в крови, так как при разных вариантах течения средние величины не имели существенных отличий (стабильное течение 632,2±47,67 нг/мл, фибрилляция предсердий 699,0±90,57 нг/мл, прогрессирующее течение 640,5±12,5 нг/мл).

Для гомозигот по АА и GG аллелям гена химазы выявлено значимое различие показателей ТIMP-1 в группах больных с вариантом фибрилляция предсердий (для генотипа АА 786,5±40,5 нг/мл; для генотипа GG 820±30 нг/мл) и вариантом прогрессирующего течения (для генотипа АА 428±11 нг/мл; для генотипа GG 562,5±71,5 нг/мл). Гетерозиготы вне зависимости от варианта течения имели сходные по своему значению средние величины ТIMP-1 (фибрилляция предсердий 586,4±33,5 нг/мл, прогрессирующее течение 640,5 ± 12,4 нг/мл) (рисунок 3).

Ось Y: TIMP-1 — тканевый ингибитор металлопротеиназ -1 нг/мл; ось X: 1 — стабильное течение, 2 — фибрилляция предсердий, 3 — прогрессирующее течение. CМА1 — полиморфизм гена химазы A(-1903)G

Рисунок 3. — Распределение значений маркера тканевого ингибитора металлопротеинз -1 в зависимости от полиморфного варианта гена химазы у больных с различными вариантами течения ГКМП

 Для всех вариантов изучаемого полиморфизма СМА1 было характерно увеличение содержания ТIMP-2 у больных с прогрессирующим вариантом течения.(AG генотип 105±12 нг/ мл, GG 93,5±0,5 нг/мл, АА 75±2 нг/мл; р=0,074).

Обсуждение результатов

В ходе выполнения исследования было установлено, что средний уровень ТIMP-1 в группе больных ГКМП был ниже, чем в контрольной группе, при этом самые низкие значения этого показателя были отмечены у больных с вариантом ФП. В этой же группе больных была статистически значимо повышен уровень ММР-3.

Вероятно, наблюдаемое нарушение соотношения ММР-3 и TIMP-1, у больных с клиническим вариантом ФП,  отражает дисбаланс процессов синтеза и распада коллагена и усиление деградации внеклеточного матрикса, что обуславливает дилатацию полостей сердца и индицирование образования фиброза. Выраженная дилатация полости левого предсердия и интерстициальный фиброз лежат в основе развития ФП. При варианте прогрессирующего течения, напротив, наблюдалось повышение концентрации TIMP-1 и снижение концентрации ММР-3, что может свидетельствовать об активации процессов образования коллагена у таких больных. Повышенный фиброз приводит к развитию выраженной диастолической дисфункции, обуславливающей хроническую сердечную недостаточность у больных с вариантом прогрессирующего течения.   Сходные результаты были представлены в работе А.Г. Гасанова 2009 г. [14], который выявил снижение уровня ММР-1, сопровождающееся повышением концентраций ТIMP-1 у детей  с ГКМП, в то время как у больных дилатационной кардиомиопатией было отмечено обратное соотношение. Уровень ММР-3 в данном исследовании не оценивали. Аналогичные данные были получены  Timms PM  в 2002 г. и Lindsay в 2002г. у больных с артериальной гипертонией [15, 16].  

Обнаруженная связь полиморфизма MMP-3 -1171,  AGTR1, СМА1 с маркером TIMP-1 указывает на генетически опосредованное усиление протеолитических процессов у больных ГКМП. Ген AGТR1 кодирует рецепторы к АТ II 1-го типа. В ходе данного исследования установлено, что для генотипа АС полиморфизма AGTR 1 характерно снижение средних значений ТIMP-1 по мере прогрессирования заболевания, что соответствует результатам, полученных у всех больных. Вероятно, генотип АА оказывает стабилизирующее действие на уровень ТIMP-1 в крови, так как при разных вариантах течения при данном генотипе средние величины TM P-1 не имеют существенных отличий.

Выявленная связь генотипа 6А/5А полиморфизма гена ММП-3 с гипертрофией межжелудочковой перегородки,  подтверждает влияние системы ММП на формирование гипертрофического ремоделирования миокарда у больных ГКМП.

Для более полного понимания механизмов участия системы ММП в прогрессировании заболевания целесообразно проведение дальнейших исследований с увеличением выборки и исследованием маркеров не только в крови, но и в тканях.

Заключение

Таким образом, можно предположить, что определение уровней маркеров ММП-3 и ТIMP-1 можно использовать для прогнозирования течения ГКМП.

 Литература

  1. Ramaraj R. Hypertrophic cardiomyopathy: etiology, diagnosis, and treatment. Cardiol Rev 2008;16:172—180.
  2. Kassiri Z., Khokha R. Myocardial extra-cellular matrix and its regulation by metalloproteinases and their inhibitors. Thromb Haemost 2005;93:212—219.
  3. Lombardi R., Betocchi S., Losi M.A., et. al. Myocardial collagen turnover in hypertrophic cardiomyopathy. Circulation 2003;108:1455—1460.
  4. Doolan G., Nguyen L., Chung J., et al. Progression of left ventricular hypertrophy and the angiotensin-converting enzyme gene polymorphism in hypertrophic cardiomyopathy. Int J Cardiol 2004;96:157—163
  5. Ortlepp J.R., Vosberg H.P., Reith S., et al. Genetic polymorphisms in the renin-angiotensinaldosterone system associated with expression of left ventricular hypertrophy in hypertrophic cardiomyopathy: a study of five polymorphic genes in a family with a disease causing mutation in the myosin binding protein C gene. Heart 2002;87:3:270—275.
  6. Yamada Y., Izawa H., Ichihara S., et al. Prediction of the risk of myocardial infarction from polymorphisms in candidate genes // New Eng J. Med. — 2002. — Vol. 347, № 24. — P. 1916–1923.]
  7. Ye S., Watts G.F., Mandalia S. et al. Preliminary report: genetic variation in the human stromelysin promoter is associated with progression of coronary atherosclerosis. Brit Heart J 1995;73:209—215.
  8. Humphries S.E., Luong L.A., Talmud P.J. еt al. The 5A/6A polymorphism in the promoter of the stromelysin-1 (MMP–3) gene predicts progression of angiographically determined coronary artery disease in men in the LOCAT gemfi brozil study. Atherosclerosis 1998;139;49—56.
  9. Deardorff R., Spinale F.G. Cytokines and matrix metalloproteinases as potential biomarkers in chronic heart failure. Biomark Med 2009;3:513—523.
  10. López B., González A., Díez J. Circulating biomarkers of collagen metabolism in cardiac diseases.  Circulation 2010;121:1645-1654
  11. Griva M., Naplava R., Spendlikova M., et. al. Potential role of selected biomarkers for predicting the presence and extent of coronary artery disease. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2010;154:219—225.
  12. Zachariah J.P., Colan S.D., Lang P., et. al. Circulating matrix metalloproteinases in adolescents with hypertrophic cardiomyopathy and ventricular arrhythmia. Circ Heart Fail 2012;5:462—466.
  13. Беленков Ю.Н., Привалова Е.В., Каплунова В.Ю., и др. Анализ морфофункциональных параметров сердца и полиморфизмов генов ренин – альдостероновой системы у больных с различными вариантами течения гипертрофической кардиомиопатии / Кардиология 2010:50(6):27—35.
  14. Гасанов Алекбер Газанфар оглы. Матриксные металлопротеиназы и особенности апоптоза при кардиомиопатиях и врожденных пороках сердца у детей

Научная библиотека диссертаций и авторефератов disser Cat http://www.dissercat.com/content/matriksnye-metalloproteinazy-i-osobennosti-apoptoza-pri-kardiomiopatiyakh-i-vrozhdennykh-por#ixzz2jgDTGQ94 Москва 2009г.

  1. Timms P.M., Wright A., Maxwell P., et al. Plasma tissue inhibitor of metalloproteinase-1 levels are elevated in essential hypertension and related to left ventricular hypertrophy. Am J Hypertens 2002;15:269—272.
  2. Lindsay M.M., Maxwell P., Dunn F.G. TIMP-1: a marker of left ventricular diastolic dysfunction and fibrosis in hypertension. Hypertension 2002;40:136—141.

Сведения об авторах:

Кожевникова Мария Владимировна — к.м.н., ассистент кафедры кафедры госпитальной терапии № 1 лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

Каплунова Вера Юрьевна — д.м.н., главный научный сотрудник НИО «Метаболический синдром» НИЦ

Шакарьянц Гаянэ Андрониковна — к.м.н., ассистент кафедры

E-mail: kozhevnikova-m@inbox.ru